Voir l'invisible avec la RMN de l'état solide.Seeing the invisible with solid-state NMR.
Mes projets partagent une difficulté commune : ce sont des biomatériaux complexes, hydratés et désordonnés, qu'on ne peut pas cristalliser. La RMN de l'état solide est donc l'outil qui me permet de les décrire malgré tout, atome par atome.My projects share a common difficulty: they are complex, hydrated, disordered biomaterials that can't be crystallized. Solid-state NMR is therefore the tool that lets me describe them anyway, atom by atom.
La RMN, une technique qui explore l'entièreté du vivantNMR, a technique that explores the full breadth of life
Les bactéries, plantes, algues et champignons sont tous constitués au moins partiellement de glycoprotéines qui se retrouvent donc dans tout l'arbre du vivant (bactéries, champignons, plantes, algues). L'intérêt pour leur étude par RMN n'a cessé de croître depuis les années quatre-vingt-dix. Voici un résumé de la revue de la littérature que j'ai co-rédigée en 2021 et publiée dans le prestigieux journal Chemical Reviews.Bacteria, plants, algae and fungi are all at least partly built from glycoproteins found throughout the tree of life (bacteria, fungi, plants, algae). Interest in studying them by NMR has kept growing since the 1990s. Below is a summary of the literature review I co-authored in 2021, published in the prestigious journal Chemical Reviews.
Arbre phylogénétique simplifié, les organismes couverts par la revue sont en gras, et nombre de publications mentionnant l'utilisation de la RMN. Ces publications sont regroupées entre les années 1991 et 2020.Simplified phylogenetic tree; organisms covered by the review are in bold. Number of publications mentioning the use of NMR, spanning the years 1991 to 2020.
Faire tourner l'échantillon à l'angle magiqueSpinning the sample at the magic angle
Dans un solide désordonné, les interactions magnétiques/chimiques entre noyaux/spins « brouillent » le signal RMN. L'astuce : placer l'échantillon dans un petit cylindre appelé rotor et le faire tourner très vite, à plusieurs milliers de tours par seconde (110, voire 150 kHz), autour d'un axe incliné à 54,7° par rapport au champ magnétique. C'est l'angle magique. Cette rotation permet de moyenner certaines des interactions parasites et révèle des spectres beaucoup plus nets, résolus et facilement interprétables.In a disordered solid, magnetic/chemical interactions between nuclei/spins "blur" the NMR signal. The trick: pack the sample into a small cylinder called a rotor and spin it very fast, at thousands of revolutions per second (110 or even 150 kHz), around an axis tilted 54.7° from the magnetic field. That's the magic angle. This spinning averages out some of the unwanted interactions and reveals spectra that are much sharper, better resolved, and easier to interpret.
Sensibilité RMN des principaux noyaux étudiés, en fonction de leur abondance naturelle. Le proton (¹H) est à la fois très abondant et très sensible. À l'inverse, le carbone est moins sensible et surtout beaucoup moins abondant naturellement : un marquage isotopique est donc nécessaire pour l'observer dans la plupart des cas. Le phosphore, quant à lui, est très abondant et assez sensible, ce qui sera utile pour l'étude de la bave du vers de velours.NMR sensitivity of the main nuclei studied, as a function of their natural abundance. ¹H is both highly abundant and highly sensitive. By contrast, carbon is less sensitive and, above all, far less naturally abundant: isotopic labelling is therefore required in most cases. Phosphorus, on the other hand, is highly abundant and fairly sensitive, which will prove useful in studying velvet worm slime.
Schématisation d'une sonde RMN de l'état solide (sonde 3,2 mm). On y voit le rotor, le stator placé à l'angle magique, ainsi que les flux de gaz permettant de surélever le rotor (bearing gas) et de le faire tourner (drive gas).Schematic of a solid-state NMR probe (3.2 mm probe). Visible components include the rotor, the stator positioned at the magic angle, and the gas flows used to levitate the rotor (bearing gas) and spin it (drive gas).
Illustration des couplages et leurs fréquences correspondantes qui interviennent et élargissent les spectres RMN.Illustration of the couplings and their corresponding frequencies that broaden NMR spectra.
La RMN des solutions est limitée aux molécules solubles, alors que la RMN de l'état solide peut observer tout type de molécules, mais souffre d'une faible résolution, d'où l'intervention de la rotation à l'angle magique.Solution NMR is limited to soluble molecules, whereas solid-state NMR can observe any type of molecule, but suffers from poor resolution, hence the use of magic-angle spinning.
Schématisation de rotors de différents diamètres, permettant de contenir différentes quantités d'échantillon et d'atteindre différentes fréquences maximales de rotation. Plus un rotor est petit, plus la quantité d'échantillon est réduite, mais plus la vitesse de rotation maximale est élevée, ce qui améliore la résolution du spectre. Détection du proton en RMN de l'état solide : plus on tourne vite, plus le spectre est bien résolu.Schematic of rotors of different diameters, each accommodating a different sample amount and reaching a different maximum spinning speed. A smaller rotor holds less sample but can spin faster, improving spectral resolution. ¹H detection in solid-state NMR: the faster the spinning speed, the better the spectral resolution.
Transférer l'aimantation : la polarisation croiséeTransferring magnetization: cross-polarization
Le proton (¹H) est abondant et très sensible. Néanmoins, il se présente sur une gamme de déplacements chimiques (ppm) très restreinte : les spectres proton en RMN solide sont donc très mal résolus et difficiles à interpréter. À l'inverse, le carbone, l'azote et le phosphore, les noyaux qui informent le plus sur la structure des protéines, résonnent avec une faible sensibilité mais sur une grande gamme de déplacements chimiques. La polarisation croisée (CP) exploite le couplage dipolaire entre protons et ces noyaux voisins pour leur transférer une partie de cette forte polarisation, sous une irradiation synchronisée avec la rotation à l'angle magique : la condition de Hartmann-Hahn. Le gain de signal, jusqu'à 4 fois pour le carbone, fait de la CP la pierre angulaire de presque toutes mes expériences de RMN de l'état solide. C'est ce même principe de relais, poussé à l'échelle des électrons, qui est à la base de la MAS-DNP présentée plus loin et qui permet un gain de sensibilité encore plus fort, même sur des échantillons non marqués isotopiquement au ¹³C ou au ¹⁵N. Il existe d'autres transferts d'aimantation très utilisés en RMN-és. Par exemple, la séquence d'impulsion INEPT, qui permet de détecter des molécules très mobiles, et la séquence d'impulsion multiCP, qui, tout en conservant les avantages de sensibilité de la polarisation croisée, permet d'obtenir un spectre quantitatif là où la polarisation croisée ne détecte que les molécules rigides.¹H is abundant and highly sensitive. Yet it covers a very narrow chemical shift range (ppm): solid-state ¹H spectra are therefore poorly resolved and hard to interpret. By contrast, carbon, nitrogen and phosphorus, the nuclei that carry the most structural information about proteins, resonate with low sensitivity but across a much wider chemical shift range. Cross-polarization (CP) exploits the dipolar coupling between protons and these neighbouring nuclei to transfer part of that strong polarization to them, under irradiation synchronised with the magic-angle spinning: the Hartmann-Hahn condition. The resulting signal gain, up to fourfold for carbon, makes CP the cornerstone of nearly every solid-state NMR experiment I run. It is this same relay principle, scaled up to the level of electrons, that underlies the MAS-DNP described further down and that delivers an even greater sensitivity gain, even on samples not isotopically labelled with ¹³C or ¹⁵N. Other magnetization transfers are widely used in solid-state NMR. For example, the INEPT pulse sequence detects highly mobile molecules, while multiCP retains the sensitivity advantages of cross-polarization while yielding a quantitative spectrum where standard CP only detects rigid molecules.
Quelques exemples de séquences d'impulsion permettant différents transferts d'aimantation. La CP présente une sensibilité plus grande que la polarisation directe (DP), mais ne détecte que les molécules rigides. Par ailleurs, l'INEPT va plutôt détecter des molécules très mobiles, et le multiCP permet d'obtenir un spectre quantitatif.Some examples of pulse sequences enabling different magnetization transfers. CP offers greater sensitivity than direct polarization (DP), but only detects rigid molecules. INEPT preferentially detects highly mobile molecules, while multiCP yields a quantitative spectrum.
Booster le signal : la MAS-DNPBoosting the signal: MAS-DNP
Le signal RMN est intrinsèquement faible, ce qui pose un problème particulier pour des échantillons non marqués comme la bave de vers de velours. La polarisation dynamique nucléaire (DNP) irradie l'échantillon par micro-ondes pour transférer la forte polarisation d'électrons d'un agent radicalaire vers les protons voisins, qui la relaient ensuite au noyau d'intérêt (¹³C, ³¹P...). Un gain de signal final peut ainsi atteindre 50 à 100 fois. J'ai utilisé une sonde MAS-DNP à triple résonance ¹H-¹³C-³¹P, unique en Amérique du Nord, pour sonder les signaux que la RMN classique ne peut pas voir sur la bave de vers de velours, et ainsi détecter et prouver que les phosphonates présents dans la bave du vers de velours étaient reliés à des sucres avant d'être reliés à des protéines complexes du slime.NMR signal is intrinsically weak, which is a real problem for unlabelled samples like velvet worm slime. Dynamic nuclear polarization (DNP) irradiates the sample with microwaves to transfer the strong electron polarization of a radical agent to nearby protons, which then relay it to the nucleus of interest (¹³C, ³¹P...). The final signal gain can reach 50- to 100-fold. I used a ¹H-¹³C-³¹P triple-resonance MAS-DNP probe, unique in North America, to probe signals classic NMR simply cannot see in velvet worm slime, and thereby detect and prove that the phosphonates in velvet worm slime were linked to sugars before being linked to complex slime proteins.
(A) Principe schématisé de la MAS-DNP. Le transfert de polarisation passe d'un bain abondant d'électrons vers celui des protons, puis vers le noyau d'intérêt. La température, les temps de relaxation des différents noyaux et des électrons peuvent influencer chaque étape et faire perdre des niveaux de polarisation en chemin. (B) Les agents polarisants biradicalaires utilisés dans mon étude de la bave de vers de velours (AMUPol, AsymPolPOK). (C) Le spectromètre DNP complet : un aimant et une console RMN classiques auxquels s'ajoutent une sonde dédiée, un gyrotron pour émettre des micro-ondes et un système de refroidissement de la sonde à l'hélium et à l'azote liquide.(A) Schematic principle of MAS-DNP. Polarization transfers from an abundant bath of electrons to protons, then to the nucleus of interest. Temperature and the relaxation times of the different nuclei and electrons can influence each step and cause polarization losses along the way. (B) The biradical polarizing agents used in my velvet worm slime study (AMUPol, AsymPolPOK). (C) The full DNP spectrometer: a standard NMR magnet and console, supplemented by a dedicated probe, a gyrotron to emit microwaves, and a helium/liquid-nitrogen probe-cooling system.
Du spectre 1D à la carte des contacts en 2DFrom the 1D spectrum to a 2D contact map
Un spectre 1D donne une empreinte chimique globale. Pour aller plus loin, des séquences d'impulsions 2D comme l'INADEQUATE (corrélations à travers les liaisons chimiques) ou le PDSD (corrélations à travers l'espace) révèlent quels atomes (et donc quelles molécules) sont physiquement en contact. C'est ainsi que j'identifie, par exemple, quels sucres touchent quelles protéines dans une paroi cellulaire.A 1D spectrum gives an overall chemical fingerprint. To go further, 2D pulse sequences like INADEQUATE (through-bond correlations) or PDSD (through-space correlations) reveal which atoms (and therefore which molecules) are physically in contact. This is how I identify, for instance, which sugars touch which proteins in a cell wall.
Quelques séquences d'impulsion 2D les plus utilisées dans mon travail, toutes basées sur le couplage homonucléaire ¹³C-¹³C. (A) L'INADEQUATE, basée sur les couplages scalaires ¹³C-¹³C à travers les liaisons chimiques. (B) Les expériences de type RFDR (Radio Frequency Driven Recoupling). (C) Les expériences basées sur la diffusion de spin ¹³C-¹³C, comme le PDSD ou le DARR/CORD/PARIS. (D) La diffusion de spin ¹H-¹H précédée ou suivie d'un transfert de polarisation hétéronucléaire ¹H-¹³C, comme les séquences de type CHHC.Some of the 2D pulse sequences most used in my work, all based on homonuclear ¹³C-¹³C coupling. (A) INADEQUATE, based on through-bond ¹³C-¹³C scalar couplings. (B) RFDR-type experiments (Radio Frequency Driven Recoupling). (C) ¹³C-¹³C spin diffusion-based experiments, such as PDSD or DARR/CORD/PARIS. (D) ¹H-¹H spin diffusion preceded or followed by heteronuclear ¹H-¹³C polarization transfer, as in CHHC-type pulse sequences.
À gauche, un spectre INADEQUATE : en suivant les systèmes de spin ¹³C-¹³C à travers les liaisons chimiques, il révèle les corrélations carbone-carbone à l'intérieur d'une même molécule. À droite, un spectre CORD : basé sur la diffusion de spin à travers l'espace, il permet de voir les contacts entre atomes voisins dans l'espace, qu'ils appartiennent ou non à la même molécule.Left: an INADEQUATE spectrum. By following ¹³C-¹³C spin systems through chemical bonds, it reveals carbon-carbon correlations within a single molecule. Right: a CORD spectrum. Based on through-space spin diffusion, it detects contacts between spatially close atoms, whether they belong to the same molecule or not.
Cartographier l'hydratation et l'ordreMapping hydration and order
Un biomatériau n'est jamais uniforme : la soie d'araignée, comme la bave de vers de velours ou la paroi d'une algue, alterne des zones cristallines et des domaines amorphes flexibles. Un byssus de moule combine collagène rigide et gaine protéique souple et hydratée. La RMN de l'état solide distingue ces régions sans les séparer physiquement. L'efficacité du transfert CP, par exemple, dépend directement de la mobilité locale : signal de polarisation croisée dominant pour le rigide (peu de mouvement, couplage dipolaire fort), signal qui s'efface pour les molécules mobiles. Ainsi, comparer une fibre ou un échantillon sec et hydraté révèle, résidu par résidu, où l'eau s'installe et ce qu'elle assouplit, tout en préservant la structure globale. Par ailleurs, mes travaux m'ont amené à développer d'autres séquences d'impulsion qui permettent, sur un échantillon marqué au ¹³C, d'observer et d'éditer le spectre en fonction du niveau d'hydratation des molécules.A biomaterial is never uniform: spider silk, like velvet worm slime or an algal cell wall, alternates crystalline zones with flexible amorphous domains. A mussel byssus combines rigid collagen with a soft, hydrated protein sheath. Solid-state NMR tells these regions apart without separating them physically. CP transfer efficiency, for instance, depends directly on local mobility: a dominant cross-polarization signal for rigid regions (little motion, strong dipolar coupling), a vanishing one for mobile molecules. Comparing a dry and a hydrated fiber or sample thus reveals, residue by residue, where water settles in and what it loosens up, all while the overall structure is preserved. Beyond that, my work led me to develop additional pulse sequences that allow, on a ¹³C-labelled sample, to observe and edit the spectrum as a function of the hydration level of the molecules.
Spectre ¹³C RMN de l'état solide d'une paroi de microalgue avant (gauche) et après (droite) édition en eau. L'édition en eau sélectionne les signaux des molécules hydratées et supprime ceux des molécules rigides et anhydres.Solid-state ¹³C NMR spectrum of a microalgal cell wall before (left) and after (right) water-editing. Water-editing selects signals from hydrated molecules while suppressing those from rigid, anhydrous components.
Résultat de l'analyse par édition en eau : les sucres (polysaccharides) de la paroi d'algue sont significativement plus hydratés que ses acides aminés (protéines). Nous avons également montré dans cet article que les acides aminés glycosylés présentent un comportement intermédiaire.Results of the water-editing analysis: the sugars (polysaccharides) of the algal cell wall are significantly more hydrated than its amino acids (proteins). We also showed in this article that glycosylated amino acids display an intermediate hydration behavior.
Un projet qui demande de la RMN de l'état solide ?A project that needs solid-state NMR?