Caractérisation RMN de l'amidonNMR characterization of starch

Attribution complète des déplacements chimiques de l'amidon et de ses constituants (amylose, amylopectine) par RMN 2D ¹³C à l'état solide, ex situ et directement dans des cellules de microalgues intactes. Cet article est aussi l'occasion de proposer une quantification in cellulo de l'amidon.Full chemical-shift assignment of starch and its constituents (amylose, amylopectin) via 2D ¹³C solid-state NMR, both purified and directly inside intact microalgal cells. This paper also introduces an in cellulo quantification of starch.

L'amidon de réserve est un mélange complexe d'amylose et d'amylopectine, organisé en couches cristallines (types A et B) et amorphes. Personne n'avait encore de carte complète de ses déplacements chimiques en RMN du ¹³C à l'état solide, et encore moins un moyen de l'étudier sans casser la cellule, directement dans son contexte biologique, de cellules vivantes.Storage starch is a complex mix of amylose and amylopectin, organized into crystalline layers (A- and B-type) and amorphous regions. No one yet had a complete map of its solid-state ¹³C chemical shifts, let alone a way to study it without breaking the cell, directly in its biological context, inside living cells.

J'ai cultivé la microalgue avec du NaH¹³CO₃ comme seule source de carbone pour l'enrichir uniformément en ¹³C, puis combiné deux voies de transfert de polarisation en RMN 2D ¹³C INADEQUATE : la polarisation croisée (CP), sensible aux régions rigides et cristallines, et l'effet Overhauser nucléaire (NOE), sensible aux régions mobiles et amorphes. En comparant amidon purifié, mutant sans amidon et cellules entières, j'ai pu isoler par soustraction spectrale le signal de l'amidon directement in situ.I grew the microalga on NaH¹³CO₃ as its sole carbon source to uniformly ¹³C-label it, then combined two polarization-transfer pathways in 2D ¹³C INADEQUATE NMR: cross-polarization (CP), sensitive to rigid, crystalline regions, and the nuclear Overhauser effect (NOE), sensitive to mobile, amorphous regions. By comparing purified starch, a starch-less mutant, and intact cells, I could isolate the starch signal directly in situ via spectral subtraction.

Première attribution complète des résonances de l'amylose et de l'amylopectine, y compris celles, jamais décrites, des extrémités non réductrices des chaînes. Le ratio CP/NOE a permis de quantifier la cristallinité (validée par diffraction des rayons X) et de distinguer amidon natif, rétrogradé et amorphe. Surtout, cette approche a permis pour la première fois de caractériser le type cristallin et la cristallinité de l'amidon directement à l'intérieur de cellules intactes, ouvrant la voie au suivi non invasif du métabolisme de l'amidon.The first complete assignment of amylose and amylopectin resonances, including previously undescribed signals from the chains' non-reducing end groups. The CP/NOE ratio quantified crystallinity (cross-validated by X-ray diffraction) and distinguished native, retrograded, and amorphous starch. Most importantly, this approach enabled, for the first time, direct characterization of starch's crystalline type and crystallinity inside intact cells, opening the door to non-invasive monitoring of starch metabolism.

La RMN 2D ¹³C INADEQUATE relie chaque carbone à son voisin par la liaison chimique qui les unit, donnant une carte de corrélations sans ambiguïté pour attribuer chaque résonance. En faisant varier la façon d'amener la polarisation vers le ¹³C, on choisit aussi quelle partie de l'amidon répond.2D ¹³C INADEQUATE NMR connects each carbon to its neighbour through the chemical bond joining them, giving an unambiguous correlation map for assigning every resonance. Varying how polarization reaches the ¹³C also selects which part of the starch responds.

Le ratio des intensités CP/NOE devient alors une mesure directe de la cristallinité, sans avoir besoin de casser ou d'extraire l'amidon. La microalgue est cultivée avec du NaH¹³CO₃ comme seule source de carbone, ce qui l'enrichit uniformément en ¹³C et rend ces expériences possibles directement dans la cellule.The CP/NOE intensity ratio then becomes a direct measure of crystallinity, without needing to break or extract the starch. The microalga is grown on NaH¹³CO₃ as its sole carbon source, uniformly ¹³C-labelling it and making these experiments possible directly inside the cell.